很大一部分遗传病是由单核乙酰酸凋亡引来的，这种凋亡可能亦会被RNA芯片脱甲醇底物（被称为序列脚本语言（BEs））当作为途径。BEs通过尿嘧啶和肌乙酰之前间产物，通过单核酸DNA特异性半胱甲醇酸或腺乙酰脱甲醇底物，使单个C·G到T·A或A·T到G·C等位基因组生成，这些底物与催化受损的Cas9融合。 这些等位基因组叠加分立于核乙酰酸DNA挤压或位与定向修复，并且必须在生物合成后第一一个组织之前在巨噬细胞内顺利完成有效校对。早先的体外研究工作指出，胞乙酰序列校对（CBEs）可以在巨噬细胞之前引来成千上万个sgRNA分立核糖体第一组的广泛脱靶凋亡，在诱发多能生殖巨噬细胞和巨噬细胞期胚胎之前引来数百个全等位基因第一组的脱靶凋亡。总之，这些数据库指出，CBE的表示可能亦会对症状的领域造成相当大的风险，本文评估巨噬细胞内体第一一个组织之前半胱甲醇酸序列校对操作过程之前的脱靶畸变，并建立一种使CBE表示持续时间也就是说的传递工具。
为了评估CBEs在巨噬细胞内的非靶向脱甲醇起着，本文着重研究工作了Pahenu2血清尿症模型，该模型可以通过AAV特异性的金黄色葡萄球菌（Sa）KKH–CBE3种系统转入血清消化种系统来治愈。运用于双AAV-intein分裂种系统将其种系统引进Pahenu2血清之前，以不对外显子之前引来疾病的T-to-C凋亡。首先运用于RNA化学合成评估核糖体第一组范围的脱靶去甲醇起着。将表示SaKKH–CBE3的位点转染到HEK293T巨噬细胞之前造成了超过39000个C-to-U叠加。为了确定在肾内半胱甲醇酸序列校对操作过程之前确实引发类似于的核糖体第一组范围的脱靶凋亡率，运用于AAV8将SaKKH–CBE3种系统地引进Pahenu2血清。8周后，当AAV载体的转等位基因表示达到振幅时，从消化种系统提取RNA，并运用于RNA序列统计分析。尽管注意到到23%的途径校对，与处理方式方式的相符合第一组相比之下，核糖体第一组范围的C-to-U叠加不会增高。
半胱甲醇酸校对前提引发在处理方式过的HEK293T巨噬细胞之前ACW的迥然各有不同APOBEC明确序列内，但在处理方式过的血清消化种系统之前不引发。寻常的是，当比较各有不同样本之前的SaKKH-CBE3表示时，注意到到HEK293T巨噬细胞的核糖体技术水平比消化种系统高三个总能量。为了研究工作CBE过度表示确实与体外高非途径校对引发率相关，将低静脉注射的SaKKH-CBE3 mRNA和sgRNA转染到掺入Pahenu2变异外显子7的HEK293T和Hepa巨噬细胞之前。与位点转染相比之下，CBE表示减少了18倍，在途径校对时保留了63%，但显著减少了RNA脱靶凋亡。
接下来评估了AAV特异性的将SaKKH–CBE3转换成Pahenu2血清确实亦会造成了等位基因第一组DNA的脱靶校对。在原本的研究工作之前不会发现在预见的非靶变异上有sgRNA依赖性凋亡，但在第一一个组织的序列校对操作过程之前确实引发随机的非sgRNA依赖性非靶等位基因凋亡仍不清楚。每个巨噬细胞的这些凋亡是各有不同的，不能用巨噬细胞之前大量DNA的全等位基因第一组化学合成来测定。从经疗法和未经疗法的相符合血清之前分离出来肾巨噬细胞，并在化学合成前将其克隆为了将为化学诱发的肾祖巨噬细胞（CLiP）。必须获得S的克隆DNA，从未经处理方式的相符合动物之前选取了3个克隆，从AAV处理方式的动物之前选取了11个克隆，并在30×覆盖率的S目标核糖体顺利完成了确认校对。AAV特异性的SaKKH–CBE3表示转入消化种系统后，不亦会造成了肾巨噬细胞对RNA和等位基因第一组DNA的大量脱靶脱甲醇起着。
对校对血清的Pahenu2等位基因的全面性统计分析标示出，由于对侧DNA核酸同时顺利完成图纹和序列切除修复，SaKKH–CBE3表示造成了靶等位基因时常转变成indel。为了减少indel的转变成，用核酸底物死亡的SaKKH–CBE2和Gam–SaKKH–CBE4交换了SaKKH–CBE3，这是第四代BE，其之前核糖核酸Mu衍生的Gam蛋白质与核乙酰酸DNA挤压的建构被认为可以减少indel的转变成、。然而，尽管SaKKH–CBE2和Gam–SaKKH–CBE4造成了较少的indels。
接下来统计分析了LNP特异性的消化种系统序列校对确实亦会造成了RNA或DNA的脱靶脱甲醇。考虑到这种工具只造成了SaKKH–CBE3的零点表示，静脉注射3毫克/千克的静脉注射后48小时顺利完成了RNA序列统计分析。重要的是，发现CBE表示技术水平在诱发mAPOBEC1的范围内，与未经疗法的相符合第一组相比之下，不亦会造成了C-U叠加增高。此外，半胱甲醇酸校对并不一定前提引发在迥然各有不同的APOBEC共识序列之前。LNP给药一个月后，SaKKH–CBE3表示实质上消失，不怎么奇怪的是，再次不会注意到到C-to-U脱靶凋亡。为了全面性评估LNP特异性的SaKKH–CBE3传递确实造成了等位基因第一组DNA的脱靶去甲醇起着，首先运用于高通量化学合成（HTS）（>10000×覆盖率）统计分析了计算预见的脱靶loci。注意到到这些核糖体不会大于文化背景技术水平的C-to-T生成。接下来着重研究工作sgRNA非依赖性脱靶凋亡，并在疗法一个月后分离出来肾巨噬细胞顺利完成克隆为了将。利用LNP特异性的SaKKH-CBE3 mRNA和化学修饰的sgRNA的序列校对必须校正疾病表型，而不亦会在核糖体第一组和等位基因第一组上测定到脱靶去甲醇起着。
本文开发了一种非病毒和短暂的序列校对工具来疗法单等位基因肾癌，不会明显的脱靶畸变。具有很低的临床前景。
Villiger, L., Rothgangl, T., Witzigmann, D. et al. In vivo cytidine base editing of hepatocytes without detectable off-target mutations in RNA and DNA. Nat Biomed Eng 5, 179–189 (2021).
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